腺病毒（adenovirus, Ad）是一种高效的基因载体工具，应用范围广，动物实验和细胞实验均适用，尤其对于一些比较难感染上的原代细胞或悬浮细胞都有着较好的感染能力。那么腺病毒载体是怎么得到的呢？小编将分两期为大家介绍下腺病毒载体包装系统及其包装过程。

(相关资料图)

一、 什么是腺病毒载体

腺病毒（adenovirus，Ad）最初由W. P. ROWE等人在人腺样体中分离得到并命名，这是一种直径为70-100nm、无包膜的线状双链DNA病毒，基因组大小约为36kb。目前已知的人腺病毒血清型有50多种。其中基于人腺病毒5型（Ad5）改造的载体使用较为广泛，其特点是人为地删除了E1和E3基因，导致腺病毒失去复制能力和一定程度上降低免疫原性，使得Ad5成为一种广泛、安全、有效的基因运输载体。

二、  腺病毒载体种类

（1）按病毒载体基因组缺失分为三代：

第一代腺病毒载体：第一代载体只去除了E1和E3基因，大大降低病毒复制可能的同时增加了载体容量，使其只能在表达E1基因的细胞中进行包装和复制。包装出毒率和滴度都比较高。但由于保留了大部分病毒基因，导致免疫原性高。第一代腺病毒载体是我们目前常用的腺病毒载体。

图1 第一代腺病毒载体示意图

第二代腺病毒载体：在第一代载体的基础上更多地去除了E2A和E4基因，这样不仅降低了腺病毒载体的免疫原性，安全性更高，还增加了载体容量。但包装难度增大，出毒率和滴度也随之下降。

图2 第二代腺病毒载体示意图

第三代腺病毒载体：这一代载体则只保留了5’端和3’端的ITR结构以及5’端的包装信号，极大增加了载体容量，可容纳达35 kb的外源基因，免疫反应极弱，对动物实验的影响最小。包装过程需要腺病毒突变体作为辅助病毒参与包装。

图3 第三代腺病毒载体示意图

（2）汉恒生物腺病毒载体分两种：

因此，汉恒生物目前也是采用的第一代腺病毒载体。常规的腺病毒载体Ad5通过其表面的纤突蛋白Fiber识别细胞表面的CAR受体来感染细胞，通常这已经能做到高效感染对绝大部分细胞，但是仍有一些极难感染上的免疫细胞或血液类细胞。汉恒生物针对这一情况开发了Ads载体，对Ad5的纤突蛋白Fiber进行嵌合型改造和筛选，最终获得了能高效感染悬浮细胞和原代T细胞的专用腺病毒载体。

表1 汉恒生物腺病毒载体种类

图4 汉恒悬浮细胞专用腺病毒ads感染白血病细胞效果

三、 腺病毒包装系统

腺病毒载体的包装系统主要有两种：AdMax系统和Adeasy系统。这两种包装系统都是二质粒系统，即需要一个骨架质粒和一个携带外源基因的穿梭质粒；都需要能够表达E1基因的293A细胞作为包装细胞，另外293A细胞为单层细胞有利于空斑的形成和观察。AdMax和Adeasy的主要区别在于病毒基因组重组的过程不同：

AdMax系统：病毒基因组重组过程简单，骨架质粒和穿梭质粒直接转染至293A细胞中重组即可。

图5 AdMax系统腺病毒质粒基因组重组示意图

Adeasy系统：该系统是在细菌中进行的。首先骨架质粒整合到BJ5183感受态细胞中，再将穿梭质粒线性化后转化到BJ5183，二者则在BJ5193中重组，验证重组效果后，转至Stbl3感受态细胞大量制备重组质粒，再线性化后，即可转入包装细胞进行包毒。

图6 Adeasy系统腺病毒质粒基因组重组示意图

可见，AdMax包装系统操作简便、包装周期短，且出毒率高，但会存在重组假阳性的风险。而Adeasy的包装过程较为复杂，周期长，但其包装成功率高，假阳性低，也是我们主要使用的包装系统。

本期关于腺病毒载体的包装系统就先介绍到这里，后面小编将继续为大家介绍腺病毒的具体包装过程，敬请关注！另外大家若有构建腺病毒载体需求，欢迎与咱们联系~